O enredo gira em torno do Rei Leónidas (Gerard Butler), que lidera 300 espartanos na batalha contra o "deus-rei" Xerxes I (Rodrigo Santoro) da Pérsia e o seu exército invasor com mais de 30 mil soldados. Enquanto a batalha acontece, a Rainha Gorgo (Lena Headey) tenta encontrar apoio para o seu marido em Esparta.
A famosa batalha de Termópilas que serviu de inspiração para a historia em quadrinhos e o filme "Os 300 de Esparta" foi uma das várias travadas entre gregos e persas durante as chamadas Guerras Médicas. A razão desse nome é que os persas eram chamados genericamente pelos gregos de "medos".
Graças ao sacrifício liderado pelos 300 espartanos, as tropas gregas tiveram tempo para se rearticular e vencer confrontos decisivos contra os persas, em uma guerra que só se encerraria 12 anos depois – com a vitória dos gregos.
